【罗工秘籍46】避免圈了个寂寞—流式聚类分析flowsom深度教学

熟悉流式的小伙伴都知道，流式细胞术实验本身倒是不难，但是难在数据分析上，不止一次有老师和罗工说：“罗工我怎么觉得流式的这个分析主观性很强啊，你看，我这圈门，稍微移动一下位置，或者说我换个圈法，是不是结果就不一样了？”的确，我们在进行流式细胞术的数据分析时，圈门的方式和逻辑体现了我们对数据把控的准确性，以及对客观数据的理解性。所以罗工一直建议大家，在数据分析前一定要自己去搞清楚指标和指标的关系，再来按照一定的逻辑进行圈门才会获得比较客观严谨的结果。首先我们要知道，通常展示的结果大部分的时候都只是流式结果的一小部分，比如我们对一个细胞进行双染，流式的结果信息就有4个，即这群细胞双染的双阳群1个，双阴群1个，单阳群2个；那3染呢？即三阳1个，三阴1个，双阳3个，单阳3个，共计8个；总的来说流式获得的亚群数其实就是2的n次方了，n=抗体数 如此一来，其实我们一个18色的染色panel，展示出的结果可能如下： 但是实际上信息量应该是多少呢？2的18次方=262144 Plots，所以很多时候我们只是把我们想展示的结果展示出来，如同主观的盲人摸象。想要让主观的盲人摸象变得那么客观一些，我们能做的就是严谨的按照逻辑思路去进行数据的圈门分析，这样结果才会让人信服，例如前不久看到的流式中文网分享的一篇人外周血亚群分析的结果，其逻辑思路之严谨，让人拜服：OMIP 077：14色方案区分所有主要的人白细胞亚群：这时有的老师小伙伴可能就要说了，罗工，我是小白，要我分析的如同上面文章一样，表示： 其实，我们也可以利用flowjo这个软件的一些插件来辅助我们的数据分析，例如FLowsom这个插件，这是一款聚类分析的插件，利用这款插件，我们可以比较客观的对我们的数据进行全自动化的聚类，分群，从而得到一些亚群，为我们进行后续的数据分析圈门提供一定的思路和参考，甚至可以后续进行T-sne分析结合，直接作为我们最终的流式结果呈现出来。首先，这款插件需要提前安装并运行R语言，具体的安装方式和R语言运行方式见如下链接：https://www.flowjo.com/exchange/#/plugin/profile?id=7当安装好后，在我们flowjo软件的Plugins下就能找到这个插件：我们在分析圈门时，对自己拿不定注意的样本先行进行一些提纯排除，例如圈门排除掉碎片，粘连体，或者是圈取CD45+，然后在提纯门内直接运行flowsom即可：运行后会弹出flowsom的界面如下：其中比较重要的3个选项要特别和大家说明：1.    选择待分析的通道，一般都是全选，但是如果gate过的门可以不选，比如在CD45+里分析，就可以这里不选CD45的通道；2.    选择系统分析的群的数量，默认是8群，但最好提前自己预估一下，看看自己的指标能分多少群出来，原理是还是可以分2的n次方群；我一般会在自己的预估群后多加3-5个群，例如分析免疫淋巴6项的TBNK,CD4/CD8，预估一般就是6群，但是通常会加到10群，这样得到的结果更准确；3.    生产的图像，这里可以选择的很多，我们默认树状图给大家展示，大家也可以自行去试试。我们还是以一个TBNK单核的染色为案例来进行分析：选择主体细胞后进行flowsom，选择聚类为10群：计算后系统得到了pop0-pop9 一共10群，这里要说的pop0就等于是全阴性群哈，也就是正式的阳性群一共是9群，但是我们看到9群里有的细胞是非常少的，所以可能就不是我们想要的目的细胞了。我们把flowsom的结果拖动到layout中查看，结果如下：排除掉pop.0，也就是中间的细胞群后，剩余的细胞群大体是分成了如下圈红的6群：也就是我们值得分析的总的来说就是这6群细胞，进一步把每个pop打开后观察，得到这6群细胞其实就是CD4T,CD8T,NK,NKT,B cell，mono cell，刚刚好6群，不多不少。实际上我们后续还可以借助一些其他的插件来可视化分析这些亚群的抗原表达情况，从而更好的分析实验结果：例如cluster这个插件，就可以很好的看到我们得到的亚群抗原表的情况了，从而明确知道是哪些亚群，进一步为后续的主观分析或者结合T-sne进行降维分析打下基础。总的来说，flowsom就是一款可以自动进行分析来获得比客观细胞亚群的插件，可以利用flowsom来进行稀少or不易观察细胞亚群的发现，也可以用它来辅助圈门，避免圈门不当造成的数据不准确，怎么样，这周的罗工秘籍，你学废了吗？ 上海优宁维生物科技股份有限公司试剂 | 耗材 | 仪器 | 软件 | 定制 | 实验服务 | 供应链  免费热线：4008-168-068 咨询邮箱：[email protected] 订购商城：www.univ-bio.com微信公众平台：优宁维抗体专家，欢迎关注！ 小优博士（小程序）：5大课堂, 让你的科研不再难！：www.univ-bio.com